产品简介：

       碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称 ALP 或 AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。
       碱性磷酸酶检测试剂盒(PNP 比色法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用 PNP 比色法，其检测原理是 Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下 p-nitrophenol 转变成醌式结构，呈较深的黄色，产物黄色越深说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法测定 400～415nm 处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平，可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的碱性磷酸酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：
1、水浴锅或恒温箱
2、比色杯
3、分光光度计
 
操作步骤(仅供参考)：
1、准备样品：
①细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在 10⁶ 以上，组织应在 100mg 以上，3000-4000g 离心取上清，
-20℃冻存，用于碱性磷酸酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。
③高活性样品：如果样品中含有较高活性的碱性磷酸酶，可以使用原有的裂解液或 PBS等进行稀释，也可以采用 ALP Assay Buffer 稀释。
2、配制显色工作液：取出 1 支 pNPP，恢复至室温后溶解于 15ml ALP Assay Buffer，混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在 6h 内用完。
3、配制标准品工作液：取出 p-nitrophenol(10mM)恢复至室温后，取 0.05ml 溶解于
0.95ml ALP Assay Buffer，使浓度达到 0.5mM 即获得 p-nitrophenol(0.5mM)，该试剂-20℃保存 2 周有效。用 p-nitrophenol(0.5mM)按下表继续稀释标准品：
 

4、ALP 加样：按照下表设置空白对照管、标准管、测定管，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的碱性磷酸酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行管。
 

5、ALP 测定：以对照调零，比色杯光径 1cm，分光光度计测定 410nm 处吸光度，如果无法检测 410nm，亦可检测 400～415nm 范围内吸光度，一般 15min 内检测完毕。
 

计算：

碱性磷酸酶活性单位的定义： 在 pH9.8 的缓冲液中， 37 ℃条件下， 每分钟水解 para-nitrophenyl phosphate 显色底物产生 1 微摩尔p-nitrophenol 所需的碱性磷酸酶的量 定 义 为 一 个 酶 活 力 单 位 。 加 入 0.5ml 1 号 标 准 管 物 质 ， 其 酶 活 力 单 位 为50uM/20min=2.5U，依次加入 2、3、4、5、6 号标准管，其浓度分别为 100μM、200μ M、250μM、400μM、500μM 的 p-nitrophenol，活力依次为 5、10、12.5、20、25U/L。以酶活力为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据酶活性定义，计算出样品中的碱性磷酸酶活性。

参考区间(37℃，健康人)：

女性：1～12 岁＜500U/L
15 岁以上 40～150U/L
男性：1～12 岁＜500U/L
12～15 岁以上＜750U/L
25 岁以上 40～150U/L
 

注意事项：

1、 待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、 建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。
3、 如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。
4、 所测样本的值高于标准曲线的上限，应用 ALP Assay Buffer 稀释样品后重新测定。
5、 1 支显色工作液配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。
6、 p-nitrophenol 溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。
7、 如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育 30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。
8、 待测样品中碱性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至 30min。
9、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12 个月有效。