产品说明
快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在5~ 15分钟内精确完成 DNA切割的限制性内切酶,适用于质粒 DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。快速内切酶快速内切酶具有如下特点:5~ 15分钟内即可完成酶切;共用一种酶切Buffer,大大简化酶切反应体系;良好的酶活冗余度,轻松应对底物过量或困难模板酶切。此外,伊势久去磷酸化、连接试剂在 Reaction酶切Buffer中具有 100%活性,支持一管化反应,提升“酶切—修饰—连接”的体验。 产品组成:
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组分 / 规格
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500Rxns
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Storage
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快速内切酶 HindIII
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500 μl
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-20℃
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10× Reaction Buffer
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1 ml ×2
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-20℃
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10× Reaction Color Buffer
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1 ml ×2
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-20℃
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建议反应条件 1× Reaction 缓冲液; 37℃温育;参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。 失活条件:80℃ 温育 20 min。 基本信息:5'...A A G C T T...3' 3'...T T C G A A...5' 使用方法 1.DNA快速酶切流程 ① 冰上按照下表配制反应体系
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质粒 DNA
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PCR 产物
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基因组 DNA
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ddH2O
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15μl
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16μl
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30μl
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10× Reaction Buffer 或 10× Reaction Color Buffer
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2μl
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3 μla
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5μl
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底物 DNA
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2 μl (up to 1 μg)
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10 μl (~0.2 μg)
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10 μl (5 μg)
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快速内切酶 HindIII
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1μl
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1μl
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5μl
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Total
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20μl
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30μl
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50μl
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a.本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度,10× Reaction Buffer加入量可适当减少至 2μl 。但由于 DNA 聚合酶同时具 有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀 (切勿涡旋) ,然后瞬时离心以收集挂壁液滴; ③ 37℃温育 15 min (质粒) ,或 15~30 min (PCR产物) ,或 30~60min (基因组DNA) ; ④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活,停止反应 (可选) 2. 双酶切或多酶切 ① 每种快速内切酶的用量为 1μl ,并根据需要适当扩大反应体系; ② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10; ③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应 温度下进行酶切反应。 3. 适用于质粒的扩大反应体系
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DNA
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1 μg
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2 μg
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3 μg
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4 μg
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5 μg
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快速内切酶 HindIII
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1μl
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2μl
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3μl
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4μl
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5μl
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10× Reaction Buffer 或 10× Reaction Color Buffer
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2μl
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2μl
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3μl
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4μl
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5μl
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Total
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20μl
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20μl
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30μl
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40μl
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50μl
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注:如果总反应体系大于 20μl ,应适当增加温育时间,尽量使用水浴、金属浴或沙浴。 质量控制
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质控项目
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质控标准
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功能活性检测
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最适反应温度下,在20μl反应体系中,1μl快速内切酶HindIII 能够在15 min内完全消化1μg λDNA 。
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星号活性测试
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最适反应温度下,将1μl快速内切酶 HindIII与1μgλDNA 共同温育3h,未检测到其他核酸酶污染或星号活 性引起的底物非特异性降解,延时酶切可能出现星号活性
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酶切—连接—再酶切检测
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最适反应温度下,使用1μl快速内切酶 HindIII 消化底物,回收酶切产物。在22 ℃下使用适量 Fast T4 DNA Ligase 可以将酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后,使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
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非特异性内切酶活性检测
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最适反应温度下,使用1μl快速内切酶 HindIII与1μg超螺旋质粒DNA共同温育4 h,使用琼脂糖凝胶电泳检测,质粒DNA仍然处于超螺旋状态。
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蓝白斑检测
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将含有单一 lacZα基因的载体以1μl HindIII消化,重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞,涂布在含有对应 抗生素、IPTG和 X-gal的LB 培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落,而连接错误 (即 DNA 末端切口不完整) 的产物将得到白色菌落。对于 Reaction 系列限制酶而言,白色菌落比例应小于 1%。
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不同DNA 中的酶切位点数量
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DNA
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ΦX174
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pBR322
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pUC57
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pUC18/19
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SV40
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M13mp18/ 19
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Adeno2
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6
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0
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1
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1
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1
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6
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1
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12
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甲基化修饰影响
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Dam
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Dcm
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CpG
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EcoKI
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EcoBI
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无影响
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无影响
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无影响
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无影响
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序列可能重叠 剪切受阻
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在不同反应缓冲液中的活性
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BIOISCO
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Thermo Scientific
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NEB
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Takara
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Reaction Buffer
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FastDigest Buffer
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CutSmart® Buffer
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uickCut™ Buffer
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活性 100%
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75%
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100%
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100%
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注:活性数据来自BIOISCO限制酶标准反应体系下的检测。
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